Лабораторная диагностика мочеполового трихомониаза

Мельник А.А., к.б.н.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения общее количество новых случаев заболеваний инфекциями, передающимися половым путем в мире составило 489,9 миллионов человек. Из них 276,4 мил. случаев относится к инфекции Trichomonas vaginalis, которое занимает первое место по распространенности (1,2). Высокая частота бессимптомных форм данной инфекции позволяет отнести трихомониаз к не контролируемым инфекциям, относительно частыми осложнениями болезни, трудностью лабораторной диагностики скрытых (хронических) форм. Трихомоноз имеет важное медицинское, социальное и экономическое значение не только из-за высокой распространенности инфекции, но и из-за доказанной роли Trichomonas vaginalis как кофактора ВИЧ-инфекции и рака шейки матки. Поэтому основной задачей сегодняшнего дня является совершенствование методов обнаружения Trichomonas vaginalis, основанных на современных достижениях лабораторной диагностики.

Впервые возбудитель трихомониаза был обнаружен в гнойных выделениях из влагалища женщин и секрета урогенитального тракта у мужчин в 1836 году французским врачом Альфредом Донне. В начале он предположил связь между патологическими выделениями у женщин и этим микроорганизмом, но потом отказался от этой идеи. В 1837 г. этот микроорганизм получил название Trihomonas, т.к. был похож на двух простейших Trichade и Monas. В течение 80 лет эти влагалищные микроорганизмы считались безвредными живыми существами и их длительное время считали сапрофитами пока в 1916 году О. Хен из Германии не подтвердил связь между паразитом и трихомониазом. С этого периода Trihomonas признана патогенным паразитом и инфекцией, передающейся половым путем.

Несмотря на то, что трихомонада – одноклеточный организм, ее строение довольно сложное. Форма трихомонад обычно грушевидная, но при прикреплении и взаимодействии с клетками слизистых оболочек у них появляются «щупальца» и по форме они напоминают амеб. Генетический материал трихомонад содержит около 60 000 генов, отвечающих за выработку белков. На поверхности оболочки этот паразит имеет более 300 разных белков из десяти групп протеинов. По этой причине (большое количество белков-антигенов) многие коммерческие серологические тесты по определению антигенов и антител являются низко- чувствительными.

У человека могут обитать три вида трихомонад. В норме в ротовой полости обитают Trichomonas tenax, в толстой кишке Trichomonas hominis. Влагалищные паразиты - Trichomonas vaginalis являются патогенными для человека и вызывают трихомониаз, для которого характерно комплексное поражение мочеполовой системы.

Trichomonas vaginalis имеют грушевидное тело, 14-30 мкм длиной, на переднем конце – 4 жгутика, ундулирующая мембрана - до середины тела, аксостиль - через все тело. (Рис.1)

Рис.1. Строение Trichomonas vaginalis:

• AF – передние жгутики,
• АХ – аксостиль,
• СО – коста, опорное образование,
• HY – гидрогеносомы,
• N – ядро,
• РВ – парабазальное тело,
• PG – парабазальное тело и аппарат Гольджи,
• RF – рекуррентный жгутик).

Трихомонады являются факультативными анаэробами, облигатными паразитами, утратившие способность синтезировать многие макромолекулы. Эти компоненты они получают из вагинального и других секретов, при фагоцитозе бактериальных клеток нормальной микрофлоры мочеполовых путей. Trichomonas vaginalis инфицируют исключительно сквамозный эпителий урогенитального тракта. Трихомонады являются и полостными, и тканевыми паразитами, т.к. они могут обитать как на поверхностных слоях эпителия, повторяя его рельеф, так и проникать достаточно глубоко в ткани, благодаря наличию протеаз (Рис.2).

Рис.2. Обнаружение Trichomonas vaginalis (1 - подвижные трихомонады в нативном препарате, 2 - трихомонады после окраски, 3 - электронная микроскопия трихомонад на эпителиальной клетке).

Существуют различные клинические классификации мочеполового трихомониаза. В зависимости от длительности заболевания и интенсивности реакции организма на внедрение возбудителя, различают следующие формы трихомониаза:

• свежий (острый, подострый, торпидный) ;
• хронический (торпидное течение и давность заболевания свыше двух месяцев);
• трихомонадоносительство (при наличие трихомонад в выделениях из влагалища отсутствуют объективные и субъективные симптомы заболевания).

Особенностью течения трихомониаза на современном этапе является то, что яркие клинические проявления заболевания встречаются все реже, преобладают вялотекущие, малосимптомные формы.

Местом внедрения трихомонад (входными воротами) у женщин является слизистая влагалища. Затем постепенно они попадают в уретру, парауретральные ходы и цервикальный канал. Возникают вульвиты, вестибулиты, бартолиниты, аднекситы, пиосальпингиты, кольпиты, эндометриты, эндоцервициты, эрозии шейки матки, циститы, уретриты. Для мочеполового трихомониаза характерно многоочаговое поражение мочеполовой системы и возникновение осложнений, в том числе первичного и вторичного бесплодия, неразвивающейся беременности и самопроизвольных выкидышей. Симптомы - зуд, жжение, дизурические расстройства, боли при половых актах. В 75% случаев - серозно-гнойные, пенистые, желто-зеленые тягучие выделения. Для тяжелых форм характерны множественные кровоизлияния, эрозии слизистой оболочки. Примерно у 2% пациенток могут быть обнаружены незначительно выраженные геморрагии на слизистой влагалища, шейки матки и цервикального канала ("клубничное проявление") (Рис.3).

Рис.3. «Клубничное проявление» в шейке матки у женщин при инфицировании Trichomonas vaginalis.

До 25-50% инфицированных женщин имеют бессимптомное носительство. Клинические симптомы развиваются только у половины таких пациенток в течение 6-ти месяцев после первичного обращения.

У мужчин местом обитания Trichomonas vaginalis является уретра, предстательная железа и семенные пузырьки. Мужской трихомониаз часто протекает бессимптомно или со стертыми симптомами, что связано с удалением значительной части трихомонад при мочеиспускании. Общие жалобы у мужчин включают скудные, слизисто-гнойные выделения, дизурию, слабый зуд или жжение немедленно после коитуса. Осложнения, связанные с трихомониазом, включают такие урогенитальные заболевания как простатит, везикулит, баланопостит, эпидидимит. Кроме уретры, при трихомониазе у 30–50% мужчин поражаются бульбоуретральные железы, предстательная железа, семенные пузырьки, мочевой пузырь. Хронический простатит как осложнение трихомонадного уретрита диагностируется у 10– 40% больных.

Лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза основывается на обнаружении в исследуемом материале Trichomonas vaginalis. Диагноз не может быть поставлен исключительно на основании клинической картины, т.к. симптомы, характерные для трихомониаза встречаются только у 2 % пациентов. Ещё в 1980 году были представлены результаты, свидетельствующие о том, что если диагноз трихомоноза устанавливать только на основании клинической картины, то 88 % инфицированных Trichomonas vaginalis женщин будет дан ложноотрицательный результат, а у 29 % неинфицированных диагноз был бы поставлен ошибочно (3). В связи с тем, что клинические симптомы зачастую не отражают реальной картины заболевания, для диагноза трихомонадной инфекции необходимо применение лабораторных методов диагностики, которые включают микроскопические, культуральные, серологические и молекулярно-биологические исследования.

Характеристика лабораторных методов для обнаружения Trihomonas Vaginalis.

Из всех методов, которые используются в настоящее время для лабораторного обнаружения Trihomonas Vaginalis культуральный метод является «золотым стандартом». Однако он не получил широкого распространения в клинической практике в связи с тем, что для диагностики необходим инкубационный период от 5 до 7 дней, (вплоть до 11-17 суток, т.к. длительность цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от посевной дозы) являющийся слишком длительным из-за возможности распространения инфекции инфицированным пациентом. Одним из запатентованных культуральных методов для обнаружения Trihomonas Vaginalis стала разработка метода пластикового конверта InPouch TV компанией BioMed Diagnostics Inc., USA с помощью которого можно выполнить как немедленную проверку, так и сохранить культуру для дальнейшего исследования. Тест- система InPouch TV - это двухкамерный мешок, позволяющий выполнять быструю проверку культуры путём микроскопии через стенку мешка. В Англии в 1997 г было проведено сравнительное исследование чувствительности питательных сред InPouch TV, Diamond и Джонсона-Трасселя. В 4 мл каждой из трех сред добавляли по 30 мкл инокулюма. Результат оценивали на первые, вторые и четвертые сутки. Было показано, что наибольшей чувствительностью обладает питательная среда InPouch TV (87 %) по сравнению с Diamond (60 %) и Джонсона-Трасселя (57 %).

Тест-система In-PouchTM TV (BioMed Diagnostics Inc., USA).

Для обнаружения Trichomonas vaginalis как у мужчин, так и у женщин культуральным методом («золотой стандарт») была разработана тест-система In-PouchTM TV, которая отличается высокой надежностью и экономичностью (9-14). Тест-система In-PouchTM TV содержит высоко селективную питательную среду для Т. Vaginalis, способствующую раннему выявлению инфекции и выявляющую меньшее число микроорганизмов по сравнению с другими селективными питательными средами. Это означает, что пациент получает необходимое лечение намного быстрее. Данная тест-система является уникальной для транспортировки. Выращивание культуры и приготовление нативного мазка сочетаются в одной процедуре. (Рис.4).

Рис.4. Набор In-PouchTM TV (BioMed Diagnostics Inc., USA).

Тест-система In-PouchTM TV включает в себя защитный барьер в виде пластикового тест- пакета, устойчивого к проникновению кислорода, состоящего из двух камер (полостей) V- образной формы, которые соединены между собой узким проходом. Двухкамерная система позволяет производить непосредственное наблюдение за только что отобранными образцами в верхней камере до попадания инокулята в нижнюю камеру, где происходит инкубация культуры (т.е трихомонаду можно определить сразу во взятом материале при наличии достаточного количества подвижных жгутиковых форм) (Рис.5).

Рис.5. Общий вид тест-системы In-pouch TV.

Питательная среда тест-системы In-PouchTM содержит следующие компоненты: пептоны, мальтозу и другие сахара, аминокислоты, дрожжевой экстракт, антигрибковые и антибактериальные агенты в фосфатном буфере, основой которого является физиологический раствор.

Процедура выполнения теста:

1.Инокуляция.

Извлечь из набора тест-систему In-PouchTM . Расправить мешочек во избежании загибов. Убедиться в том, что жидкая среда, содержащаяся в верхней камере, находится ниже уровня ленты покрытия во избежании случайного пролива жидкости во время вскрытия тест- системы. Разорвать тест-пакет вдоль линии метки, расположенной над покрытием. Раскрыть тест-пакет таким образом, чтобы можно было ввести тампон, раздвинув в стороны петли, расположенные в средней части ленты покрытия. Вставить тампон с образцом в жидкость верхней камеры тест-пакета. Аккуратно экстрагировать образец из тампона, сжимая его между стенками верхней камеры, после чего поместить тампон в контейнер для биологически опасных материалов (Рис.6).

Рис.6. Процесс инокуляции образца.

При проведении инокуляции осадка мочи (1-2 капли мочи), осадок можно инокулировать в тест-систему с помощью одноразовой стеклянной стерильной пипетки. Появление пузырьков в процессе инокуляции должно быть сведено к минимуму.

2. Срочная интерпретация результатов микроскопического исследования (нативный препарат).

Сжать закрытый тест-пакет, отогнуть верхний край вниз и трижды скатать. Затянуть проволочные концы петель, расположенных на ленте, с тем, чтобы зажать скатанный участок. Поместить верхнюю камеру тест-пакета на возвышенную платформу микроскопа, расположив пакет таким образом, чтобы нижняя часть верхней камеры оказалась на несколько миллиметров выше нижней границы зажима. Закрыть и зафиксировать зажим над мешочком. Мешочек следует рассматривать с верхней стороны зажима микроскопа. Произвести наблюдение под микроскопом под малым увеличением (100 х). Использовать большее увеличение (200-400 х) в случаях, когда требуется подтверждение (Рис.7).

Рис.7. Инокуляция образца и микроскопирование.

3. Концентрация образцов Клеточный материал можно концентрировать, если подержать мешочек в вертикальном положении не менее 15 мин перед микроскопией. Обычно трихомонады концентрируются в нижней части камеры. Произвести микроскопическое исследование с целью обнаружения подвижных организмов.

4. Культивирование и интерпретация результатов микроскопического исследования.

Быстро переместить содержимое из верхней камеры мешочка в нижнюю камеру. Скатывать тест-пакет сверху вниз до тех пор, пока лента не займет положение сверху этикетки. Загнуть проволочные концы петелек на ленте, чтобы зажать скатанный участок. Выполнение данного действия способствует поддержанию анаэробных условий культивирования. Инкубировать тест-пакеты в вертикальном положении при температуре +370 С в течение 18-24 часов. Перед интерпретацией результатов надавить пакет о край стола снизу вверх (5 раз), чтобы перемешать содержимое. Поместить нижнюю часть нижней камеры на возвышенную платформу открытого зажима микроскопа, затем закрыть и зафиксировать зажим над тест- пакетом. Исследовать под микроскопом при малом увеличением (100 х). Произвести ежедневную оценку результатов исследования с целью обнаружения подвижных трихомонад на протяжении 5-7 дней. Не принимать ошибочное движение коричневой массы мельчайших частиц побочных веществ (продуктов распада клеток) за проявление активности трихомонад.

Интерпретация

Инокулят, содержащий от 1 до 10 подвижных организмов считается достаточным для подтверждения положительного результата анализа.

Преимущества Тест-система In-PouchTM TV:

• может использоваться в амбулаторных условия, в кабинете врача;
• возможность обнаружения Trihomonas vaginalis в урогенитальных соскобах, осадке мочи, эякуляте, вагинальном отделяемом,цервикальной слизи;
• тест является менее трудоемким благодаря сочетанию двух процедур в одном тесте;
• тест способен обнаруживать единичные трихомонады;
• высокоселективная среда ингибирует рост других микроорганизмов, кроме Trihomonas vaginalis, что существенно облегчает интерпретацию результатов;
• безопасность в использовании. Нет необходимости в окрашивании и приготовлении мазков при работе с нативной Trihomonas vaginalis. Среда с патогенным биологическим материалом полностью остается в изолированном пакете, тем самым предотвращая прямой контакт с биологически опасным материалом;
• удобство хранения и транспортировки. Компактная, небьющаяся упаковка, не требующая жестких температурных режимов хранения;
• срок годности набора 1 год с момента производства,

Таким образом, используя Тест-система In-PouchTM TV можно получить возможность использовать культуральную бактериологичскую диагностику в условиях обычной лаборатории.

ЛИТЕРАТУРА

• 1. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections - 2008. 1.Sexually transmitted diseases - epidemiology. 2.Chlamydia trachomatis. 3.Neisseria gonorrhoeae 4.Syphilis.5.Trichomonas vaginalis.
• 2. WHO Global strategy for the prevention and control of sexually transmitted infections: 2006– 2015:breaking the chain of transmission, 2007.
• 3. Fouts A., Kraus S. Trichomonas vaginalis: reevaluation of its clinical presentation and laboratory diagnosis // J. Infect. Dis. - 1980. - Vol. 141. - P.137 - 143.
• 4. Crusitti T, Van Dyck E, Fbdellati S, Lada M.Trichomonasvaginalis. Comparison of PCR techniques for the diagnosis of Trichomonasvaginalis //Inst for Tropical Medicine, Anverp, Belgium. IntJSTD&AIDS 2001.
• 5. Briselden AM. J Clin Microbiol. 1994; Demeo LR. Am J Obstet Gynecol. 1996;
• 6. Huppert JS. J Clin Microbiol. 2005; Nye MB. Am J Obstet Gynecol. 2009;
• 7. Van Der Pol B. J Clin Microbiol. 2006.
• 8. Van Der Pol; Schwebke; Taylor: Posters STI & AIDS, 2013
• 9. Borchardt, K.A. and Smith, R.F. (1991).An evaluations of an inpouch TV culture method for diagnosis Trichomonas vaginalis infection, Gentourin.Med.;67:49-52.
• 10. Borchardt,K. A. ;AL-Haraci, S. and Maida,N.(1995). Prevalence of Trichomonas vaginalis in amal sexually transmitted disease clinic by interview, wet mount microscopy and In- Pouch TV culture ,Genitrourin. Med.;11:405-406.
• 11. Borchardt,K.A.; Zhang,M.Z.; Shing,H. and Flink,k.(1997). A comparison of the sensitivity of the In-Pouch TV, Diamond's, and Trichosel media for detection of Trichomonas vaginalis, Genitourin Med.; 73:297-298
• 12. Draper D, et al., Detection of T. vaginalis in pregnant women with the InPouch TV culture system, J Clinical. Microbiology. 1993;31:1016-1018.
• 13. Borchardt KA, et al. A Clinical Evaluation of Trichomoniasis in San Jose, Costa Rica using the InPouch TV test. Genitourin Med. 1992;68:328-330.
• 14. Barenfanger J, et al., Timing ad inoculation of the pouch makes no difference in increased detection of T. vaginalis by the InPouch™ Method. J Clinical Microbiology. 2002;40:1387-9.